ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΕΝΝΗΣΗ, ΘΑΝΑΤΟΣ, ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΚΑΙ ΡΗΞΕΙΣ ΤΟΥ DNA ΣΤΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

ΚΕΦ. (4) ΝΕΥΡΩΝΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗ

O νευρωνικός θάνατος με μείωση του 15 - 40% ή περισσότερο των μετα - μεταναστευτικών νευρώνων είναι ένα φαινόμενο προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στα όψιμα στάδια της ιστογένεσης. Ο νευρωνικός θάνατος συμβαίνει πιο πρώιμα στην σειρά του νευρωνικού πολλαπλασιασμού. Σε αναφορά στο νεοφλοιώδες πολλαπλασιαζόμενο επιθήλιο, ένα χαμηλό αλλά μη εξακριβωμένο επίπεδο νευρωνικού θανάτου συμπεραίνεται από την υπερανάπτυξη του επιθηλίου σε ποντίκια με εξάλειψη στα γονίδια Apaf1 και κασπάση9 και συμβαίνει στην εκθετική φάση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Η τοξικότητα (excitotoxicity), το οξειδωτικό στρες και η απόπτωση αναγνωρίζονται στον νευρωνικό θάνατο σε διάφορες νευρολογικές ασθένειες. Ερευνήθηκε από τους Kang et al (2005) ο PHF - 1 tau, ένα υπόστρωμα για ποικίλες πρωτεάσες . H ρήξη (cleavage) του PHF -1 tau δεν παρατηρήθηκε σε καλλιέργειες φλοιωδών εγκεφαλικών κυττάρων εκτιθέμενων σε excitotoxins ή οξειδωτικό στρες που προκαλεί νέκρωση των νευρικών κυττάρων.

H ρήξη του PHF - 1 tau παρατηρήθηκε σε 8 ώρες μετά από έκθεση των καλλιεργειών των φλοιωδών κυττάρων σε αποπτωτικούς παράγοντες. Η ρήξη μπλοκαρίστηκε με έγκληση από τον zDEVD - fmk, έναν αναστολέα της κασπάσης3, και συνοδεύτηκε από ενεργοποίηση της κασπάσης3. Τα επίπεδα και η ρήξη του PHF - 1 tau ήταν σημαντικά αυξημένα στην νόσο Alzheimer σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Έτσι, η ρήξη του PHF - 1 tau από την κασπάση3 συμβαίνει κατά την απόπτωση και νευρική εκφύλιση κατά τη νόσο Alzheimer, ανεξάρτητα από το οξειδωτικό στρες και την excitotoxicity.

Κατά τους Becker και Bonni (2004), η απόπτωση (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) των νευρώνων είναι μια απαραίτητα διαδικασία στην φυσιολογική ανάπτυξη του ΝΣ και συμβάλει στην νευρωνική απώλεια σε νευρολογικές κακώσεις και ασθένειες. Οι νευρώνες εκτίθενται σε ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια ερεθίσματα που περιλαμβάνουν την έλλειψη τροφικών ουσιών, έκθεση σε νευροτοξίνες, οξειδωτικό στρες και βλάβη του DNA. Αυτά τα ερεθίσματα περιλαμβάνουν σηματοδοτικές οδούς που απαρτιώνουν τον μιτοχονδριακό μηχανισμό απόπτωσης που καταλήγουν στην κυτταρική γέννηση ή θάνατο. Πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου εκφράζονται σε θνησιγενείς νευρώνες στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο και στον εγκέφαλο των ενηλίκων.

Σχετικά με το οξειδωτικό στρες και τις ρήξεις που προκαλεί στο γενετικό υλικό, μελετάται τελευταία ο ρόλος του Ape1 στη νευροτοξικότητα. Σε έρευνα των Vasko et al (2005) μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της μείωσης της έκφρασης του Ape1 (απουρινικό/ απυραμιδικό ενδονουκλεάση/ ενεργοποιητικός παράγων οξειδοαναγωγής (Ape1/Ref-1 ή Ape1) σε καλλιέργειες ιππόκαμπου και αισθητικούς νευρώνες σε διαδοχικά στάδια νευροτοξικότητας που προκαλείτο από το Η2Ο2 (υπεροξείδιο του υδρογόνου). Το Ape1 εκφράζεται σε υψηλά ποσοστά στον ιππόκαμπο και στους κινητικούς νευρώνες σε καλλιέργειες, όπως ανεδείχθη με ανοσο-ιστοχημικές μεθόδους.

Η μείωση του Ape1 μειώνει σημαντικά την βιωσιμότητα των κυττάρων σε καλλιέργειες 24 ώρες μετά από έκθεση σε Η2Ο2 για 1 ώρα. Τα μειωμένα επίπεδα του Ape1 αυξάνουν την δραστηριότητα της κασπάσης3 στα κύτταρα, 1 ώρα μετά την έκθεση σε Η2Ο2 για 1 ώρα. Η έκθεση των νευρωνικών καλλιεργειών με μειωμένη έκφραση του Ape1 σε 65μΜ Η2Ο2 στον ιππόκαμπο ή 300μΜ Η2Ο2 στους αισθητικούς νευρώνες μετά από 1 ώρα οδήγησε στην αύξηση της φωσφορυλίωσης της ιστόνης Η2Α.Χ. Η υπερέκφραση του Ape1 σε κύτταρα ιπποκάμπου και αισθητικά κύτταρα χρησιμοποιώντας αδενοϊό οδηγεί στη σημαντική αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από έκθεση στο Η2Ο2 σε ποικίλες δόσεις.

Σε έρευνα των Rabacchi et al (2004), ελέγχθη η υπόθεση ότι το ΗΝΕ (4 - hydroxynonenal), ένα παράγωγο λιπιδιακής υπεροξείδωσης είναι το κλειδί - ως μεσολαβητής- στον κυτταρικό θάνατο από την έκθεση σε β - αμυλοειδές (που σχετίζεται με τη νόσο Alzheimer). Σε έναν νευρωνικό κυτταρικό τύπο διαφορετικά θανατηφόρα ερεθίσματα μπορεί να προκαλέσουν και να ``ερεθίσουν΄΄ ειδικές οδούς απόπτωσης. Οι παραπάνω ερευνητές έδειξαν ότι η θεραπεία με ΗΝΕ σε νευρικά κύτταρα προήγαγε δοσοεξαρτώμενο θάνατο και ενεργοποίηση των κασπασών η δράση των οποίων ήταν ανεσταλμένη. Όμως, το down regulation των κασπασών -3 -7 ή -9 προσέφερε πλήρη προστασία από τον νευρωνικό θάνατο που προήγαγε το ΗΝΕ, γεγονός που συνέβαινε και με το down regulation των ρυθμιστών των κασπασών: Αpaf-1 και DIABLO.

H έρευνα έδειξε ότι η κασπάση3 δεν απαιτείτο για τον νευρωνικό θάνατο που επάγεται από το β-αμυλοειδές, τo down regulation του SOD1 ή την αποστέρηση τροφικών παραγόντων. Συμπερασματικά, η τοξικότητα του ΗΝΕ μεσολαβείται δια μέσω της κασπάσης9 εξαρτώμενης οδού, αλλά η άθροιση του ΗΝΕ δεν χρειάζεται να επιφέρει τον κυτταρικό θάνατο, ούτε είναι ένας υποχρεωτικός μεσολαβητής στον κυτταρικό θάνατο που μεσολαβείται από το β -αμυλοειδές.

Σε έρευνα των Wang et al (2004) βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη Χ φυλοσύνδετος αναστολέας της απόπτωσης (ΧΙΑΡ) προστατεύει από την ενεργοποίηση της κασπάσης και την απώλεια ιστών σε υποξία -ισχαιμία σε νεογέννητο. Συγκεκριμένα ερευνήθηκαν 9 ημερών ηλικίας γενετικά τροποποιημένα ποντίκια που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη ΧΙΑΡ και φυσιολογικά ποντίκια στα οποία ελέχθη η περίσφιξη με ράμματα της αριστερής καρωτίδας και χορήγηση 10% Ο2 για 60 λεπτά και αυτό οδήγησε σε πολλαπλά έμφρακτα στο ομόπλευρο ημισφαίριο του εγκεφάλου κατά την επανένωση.

Η ενεργοποίηση της κασπάσης- 3 και - 9 που παρουσιάστηκε στα φυσιολογικά ποντίκια δεν εμφανίστηκε στα μεταλλαγμένα ποντίκια που υπερεξέφραζαν την ΧΙΑΡ. Η ιστική απώλεια ήταν μεγαλύτερη στα φυσιολογικά ποντίκια και μικρότερη στα μεταλλαγμένα με υπερέκφραση του ΧΙΑΡ. Οι νευρώνες με βλάβη παρουσίαζαν μεγαλύτερη σήμανση στο ΧΙΑΡ κατά την επαναδιάχυση, κυρίως στον πυρήνα. Η ΧΙΑΡ πρωτεΐνη συσχετιζόταν με τους παράγοντες XAF-1, Smac και HtrA2 στους τραυματισμένους νευρώνες μετά από υποξία- ισχαιμία. Η έρευνα κατέληξε ότι η πρωτεΐνη ΧΙΑΡ που ανέστειλε την απόπτωση προστατεύει τον εγκέφαλο του νεογέννητου από την υποξία -απόπτωση.

Η απόπτωση των νευρικών κυττάρων, κατά την ανασκόπηση των Yuan et al (2003), περιλαμβάνει κυτταρικές οδούς στις οποίες συμμετέχουν η οικογένεια των κασπασών, η οικογένεια Bcl - 2 και η πρωτεΐνη Apaf -1. H απόπτωση είναι ζωτικής σημασίας μηχανισμός που ρυθμίζει τον αριθμό των νευρικών κυττάρων και η φυσιολογική σύνδεσή τους κατά την ανάπτυξη του ΝΣ. Αυτό φαίνεται εξάλλου από τις δραματικές αλλαγές στο ΚΝΣ ως αποτέλεσμα κάποιου γενετικού ελλείμματος στον μηχανισμό απόπτωσης. Έτσι, συμπερασματικά, η απόπτωση είναι ζωτικής σημασίας στη ρύθμιση της ανάπτυξης του εγκεφάλου.

Πέρα από τη νόσο Alzheimer που προαναφέρθηκε, ο θάνατος των νευρικών κυττάρων σχετίζεται και με την νόσο του Huntington η οποία χαρακτηρίζεται από την πρωτεολυτική παραγωγή Ν -τελικών θραυσμάτων από hantingtin που περιέχει επαναλαμβανόμενες μονάδες πολυγλουταμικού που σχηματίζει ενδοκυττάρια αθροίσματα στους επηρεασμένους νευρώνες. Το BAG -1 είναι μία πολυλειτουργική πρωτεΐνη που μεσολαβεί με ένα ευρύ εύρος κυτταρικών στόχων και ρυθμίζει την ανάπτυξη του κυττάρου, είναι σημαντικό σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα και η δράση του περιλαμβάνει την απόπτωση, σηματοδότηση, πολλαπλασιασμό και μεταγραφή. Προσδένεται στην αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl - 2 και προάγει την επιβίωση του κυττάρου.

Σύμφωνα με τους/τις Jana και Nukina (2005), η υπερέκφραση του BAG -1 προστατεύει το πολυγλουταμικό- εξαπλωμένο κολοβό Ν τελικό άκρο huntingtin (tNhtt) από το να επιφέρει τον κυτταρικό θάνατο. Από τη στιγμή που το BAG - 1 είναι σημαντικό για την επιβίωση των κυττάρων, η σχέση του με τα tNhtt συναθροίσματα μπορεί να διαταράσσει την φυσιολογική του λειτουργία και να προάγει τον θάνατο του κυττάρου μέσω της πολυγλουταμικού - εξαπλωμένου tNhtt.

Υπάρχει και η FNK πρωτεΐνη που κατασκευάζεται από το αντιαποπτωτικό γονίδιο Bcl -XL με αυξανόμενη δράση. Η FNK συγχωνεύτηκε με την κυρίαρχη πρωτεΐνη PTD της HIV/Tat πρωτεΐνης, ώστε να μεσολαβήσει στην εισαγωγή του FNK στα κύτταρα. H συγχωνευμένη πρωτεΐνη PTD - FNK εισήχθη σε χονδροκύτταρα σε απομονωμένο αρθρικό χόνδρο - τομές οστών, καλλιεργημένους νευρώνες και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα από μυελό των οστών, και εκτιμήθηκε η ικανότητά του να προλαμβάνει τον κυτταρικό θάνατο από την κατάψυξη και την τήξη. Το σύμπλεγμα PTD - FNK προστάτευε τα κύτταρα από την καταστροφή από την κατάψυξη και το λιώσιμο (τήξη) σε μια δοσοεξαρτώμενη σχέση. Η πρόσθεση στο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα PTD - FNK κρυοπροστατευτικών ηύξησε την επιβίωση των κυττάρων, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου στην οποία χρησιμοποιήθηκαν μόνον κρυοπροστατευτικές ουσίες. Τελικά, αναδεικνύεται ο κρυοπροστατευτικός ρόλος του πρωτεϊνικού συμπλόκου PTD - FNK (Sudo et al, 2005).

Σήμερα δίδεται μεγάλη σημασία στην έρευνα στην ιστική καταστροφή και συγκεκριμένα στο τραύμα της ΣΣ το οποίο επάγει έναν καταρράκτη παθο - χημικο -φυσιολογικών διεργασιών γνωστές σαν δευτερογενής τραυματισμός. Διάφορες πρωτεάσες συμμετέχουν στον δευτερογενή αυτό τραυματισμό στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι κασπάσες, οι calpains και οι μεταλλοπρωτεινάσες, ενεργοποιούνται από διαταραχές στη ΣΣ και έχουν συνδεθεί με τον κυτταρικό θάνατο κατά τον τραυματισμό της ΣΣ και σε άλλες βλάβες και ασθένειες του ΚΝΣ.

Η καθεψίνη - Β είναι μια ισχυρή λυσοσωματική πρωτεάση που έχει ενοχοποιηθεί στην παθολογία ασθενειών του ΚΝΣ, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του εγκεφάλου, της νόσου Alzheimer, της πλάγιας μυατροφικής σκλήρυνσης (ALS) και του εγκεφαλικού επεισοδίου. Σε έρευνα των Ellis et al (2005) ανευρέθη σημαντική αύξηση στην έκφραση του mRNA και την πρωτεϊνική έκφραση της καθεψίνης - Β που ακολουθούν τον τραυματισμό της ΣΣ.

Σε έρευνα σε ποντίκια η ενζυματική δραστηριότητα της καθεψίνης - Β αυξάνετο σημαντικά την 5η και 7η μετατραυματική ημέρα και ήταν συσχετισμένη με αύξηση στις ενεργές μορφές της καθεψίνης - Β πρωτεΐνης που είχε αναφερθεί πιο πρώιμα. Επίσης, οι παρεγχυματικοί νευρώνες φαίνεται να συμμετέχουν σε αυτήν την αύξηση η οποία αποδόθηκε, με ανοσο-ιστοχημικές αναλύσεις, στην αύξηση των φλεγμονωδών κυττάρων στην περιοχή του τραυματισμού.

Επιστρέφοντας στην απόπτωση, η αποπτωτική πρωτεάση ενεργοποιητικός παράγοντας 1 (Apaf - 1), το dATP και η προκασπάση - 9 σχηματίζουν ένα πολυμερικό σύμπλεγμα που προάγει τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών εις την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στα μιτοχόνδρια μέσα στο κυτοσόλιο. Η μεσολαβούμενη από το κυτόχρωμα c αποπτωτική οδός, όπως ελέγχθη σε Knockout πειραματόζωα, είναι ζωτικής σημασίας για την νευρωνική ανάπτυξη.

Συγκεκριμένα, ο αριθμός των νευρωνικών προγονικών κυττάρων αυξάνεται αφύσικα σε ποντίκια με έλλειψη στην κασπάση9, κασπάση3 και Apaf -1. Σε έρευνα των Honarpour et al (2001) μελετήθηκε ο εμβρυϊκός νευρωνικός θάνατος που προεκλίθη από αποστέρηση τροφικών παραγόντων ή έλλειψη της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών, με την ανάλυση του Apaf - 1 Tyrosine Kinase υποδοχέα Α (TrkA) και Apaf -1/ Munc - 18 διπλά μεταλλαγμένα ποντίκια. Η ιστολογική ανάλυση στον εγκέφαλο των διπλά μεταλλαγμένων ποντικιών έδειξε ότι ο νευρωνικός θάνατος προκαλείται από τέτοια ερεθίσματα ανεξαρτήτως του Apaf -1.

H απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και η επακόλουθη σύνδεση στον Apaf -1 είναι το κλειδί στην απόπτωση. Συγκεκριμένα, ένα σύμπλεγμα από Apaf -1, dATP και κυτόχρωμα c ενεργοποιεί μια σειρά από κυτταροπλασματικές πρωτεάσες, τις κασπάσες, που οδηγούν στον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Σε προηγούμενη έρευνα των Honarpour et al (2000), προεκλίθη μετάλλαξη στο γονίδιο του Apaf - 1 σε ποντίκια και ευρέθη στην έρευνα ότι τα περισσότερα μεταλλαγμένα στο Apaf -1 ποντίκια πέθαναν κατά την περιγεννητική ζωή, ενώ συχνή ήταν η ανάπτυξη ανωμαλιών όπως εξεγκεφαλία και κρανιοσχιστία.

Επίσης, ευρέθη ότι οι νευρικές βλάβες που αναπτύσσονταν στα Knockdown ποντίκια οφείλονται στην υπερβολική παρουσία νευρικών προγονικών κυττάρων που συνέβαινε πρώιμα στην 9.5 ημέρα της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Στην παραπάνω έρευνα βρέθηκε ότι το 5% των μεταλλαγμένων ποντικών επιβίωσαν επιτυχώς ως την ενηλικίωση. Στα ποντίκια αυτά που επιβίωσαν ο εγκέφαλος αναπτύχθηκε φυσιολογικά, όμως στα αρσενικά υπήρχε μια διαταραχή στην σπερματογένεση που οδηγούσε σε ζωτική απουσία σπέρματος. Έτσι, η μεσολαβούμενη από το κυτόχρωμα c απόπτωση δεν είναι απολύτως απαραίτητη για την φυσιολογική νευρωνική ανάπτυξη, πλην όμως είναι ζωτική για τη σπερματογένεση.

H απόπτωση και το οξειδωτικό στρες είναι καταστάσεις που προαναφέρθησαν και σχετίζονται με την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων στο ΚΝΣ και με το οξειδωτικό στρες στις ρήξεις του DNA. Σήμερα μελετάται η δράση των πολυφαινολών, ουσίες που φυσικά βρίσκονται στο κρασί, τα σταφύλια και αλλού, και για τις οποίες έχουν γίνει πολλές μελέτες και συζητήσεις σχετικά με την πρόληψη του καρκίνου. Η διαταραχή των γονιδίων που προάγουν την απόπτωση είναι το κλειδί στον καρκίνο. Οι πολυφαινόλες, λοιπόν, ενδεχομένως προλαμβάνουν τις οξειδωτικές βλάβες.

Σε έρευνα των Mercer et al (2005) μελετήθηκαν διάφορα μέλη της οικογένειας των φλαβονοειδών αν μπορούσαν να προστατεύσουν τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες του εγκεφάλου από την βλάβη, και να μειώσουν την απόπτωση που προάγεται από το οξειδωτικό στρες. Αρχικές καλλιέργειες του μεσεγκεφάλου ήταν ευαίσθητες στο οξειδωτικό στρες (ΜΡΡ+)που προκάλεσε δοσοεξαρτώμενες μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων δια μέσου μιας αποπτωτικής - νεκρωτικής συνέχειας της βλάβης.

Τα φλαβονοειδή (catechin, quercetin, chrysin, puerarin, naringenin, genestein) προστάτευαν τις καλλιέργειες του μεσεγκεφάλου από βλάβη από το ΜΡΡ+ (οξειδωτικό στρες) το οποίο μελετήθηκε με μελέτες ρήξης του DNA και την ανοσοκυτταροχημεία της τυροσινο - υδροξυλάσης (ΤΗ) των ντοπαμινεργικών νευρώνων που συνέβαινε κατά την απόπτωση. Το φλαβονοειδές catechin, επίσης, μείωνε την βλάβη που προκαλείτο από τα Η2Ο2, 4 - hydroxynonenal, rotenone και 6 υδρόξυ - ντοπαμίνη, όπως εδείχθη με την αύξηση στην βιωσιμότητα των κυττάρων και την πρόσληψη [3Η]DA. Όταν η νευροπροστασία της catechin έναντι της προκαλούμενης από το ΜΡΡ+ βλάβη συγκρίθηκε με τη νευροπροστασία που προσέφερε ο αναστολέας της κασπάσης3, ο Z- DVED - FMK, και τα 2 μείωναν τον κατακερματισμό του DNA και το πρότυπο βλάβης σε ΤΗ (τυροσίνο - υδροξυλάση) θετικούς νευρώνες.

Έτσι, αναδεικνύεται η νευροπροστατευτική δράση των φλαβονοειδών που έχουν την ικανότητα να εξασθενούν την αποπτωτική βλάβη στους ντοπαμινεργικούς (DA) νευρώνες του μεσεγκεφάλου. Από τη στιγμή που αυτοί οι DA νευρώνες είναι υπό οξειδωτικό στρες στον παρκινσονισμό, τα παραπάνω ευρήματα υποδηλώνουν ότι τα φλαβονοειδή θα μπορούσαν να παρέχουν οφέλη μαζί με άλλες αντι - οξειδωτικές θεραπείες στη νόσο του Πάρκινσον.